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  膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)極具侵襲性的腫瘤，因高侵襲性、遺傳異質(zhì)性和血腦屏障（BBB）保護(hù)，傳統(tǒng)療法效果欠佳。聲動(dòng)力療法（SDT）以其無創(chuàng)、深層組織穿透等優(yōu)勢(shì)成為新興治療方式，通過超聲激活聲敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧破壞腫瘤細(xì)胞，同時(shí)利用聲空化效應(yīng)增強(qiáng)藥物滲透。但小分子聲敏劑存在體內(nèi)代謝快、選擇性差等問題，限制了療效。盡管納米載體系統(tǒng)整合聲敏劑有所改進(jìn)，但能穿過BBB實(shí)現(xiàn)膠質(zhì)瘤協(xié)同治療的載體設(shè)計(jì)仍具挑戰(zhàn)。

  彈性蛋白樣多肽（ELPs）作為模擬天然彈性蛋白的人工多肽，憑借生物相容性好、免疫原性低、熱響應(yīng)性及可被蛋白酶降解等優(yōu)勢(shì)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注。ELPs由VPGXG五肽單元構(gòu)成，可通過序列定制實(shí)現(xiàn)對(duì)溫度、pH和光等刺激的響應(yīng)，其自組裝行為使其能負(fù)載疏水藥物，延長(zhǎng)藥物血液循環(huán)時(shí)間和提高藥物生物利用度。而多酚與金屬離子配位形成的金屬酚網(wǎng)絡(luò)（MPNs）在腫瘤化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療（CDT）和磁共振（MR）成像中展現(xiàn)潛力，特別是單寧酸/Mn2?（TM）MPNs，具有生物相容性、pH敏感性和CDT性能。其豐富的酚羥基使其可作為涂層材料吸附于納米材料上。此外，研究表明活性氧（ROS）除直接殺傷腫瘤細(xì)胞外，還可通過誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）和激活cGAS-STING通路觸發(fā)抗腫瘤免疫。Mn2?能增強(qiáng)cGAS對(duì)DNA的敏感性及cGAMP與STING的親和力，協(xié)同CDT/SDT有效激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。

  基于此，東華大學(xué)史向陽教授團(tuán)隊(duì)與法國波爾多大學(xué)Sébastien Lecommandoux教授課題組合作設(shè)計(jì)并構(gòu)建了一種巨噬細(xì)胞膜仿生的金屬-多酚網(wǎng)絡(luò)包覆彈性蛋白樣多肽膠束用于實(shí)現(xiàn)原位腦膠質(zhì)瘤的聲動(dòng)力/化學(xué)動(dòng)力/免疫治療（圖1）。研究團(tuán)隊(duì)以分子量為33.7kDa、氨基酸序列為MW[VPGVG-VPGMG-（VPGVG）2]20的ELP通過共價(jià)鍵與聲敏劑二氫卟吩e6（Ce6）鏈接，并在水溶液中通過自組裝形成納米膠束，隨后包覆由單寧酸和Mn²⁺組成的MPN，從而獲得Ce6-ELP@TM。最后，Ce6-ELP@TM被巨噬細(xì)胞膜（MMs）偽裝獲得納米藥物Ce6-ELP@TM/MM。該納米藥物的物理化學(xué)特性、體外及體內(nèi)的抗腫瘤效果、免疫激活效果及相關(guān)機(jī)制被詳細(xì)評(píng)價(jià)。

圖1. Ce6-ELP共聚物的合成（a）及Ce6-ELP@TM/MM的制備和用于原位腦膠質(zhì)瘤治療示意圖（b）。

  團(tuán)隊(duì)首先通過¹H NMR、熒光光譜、動(dòng)態(tài)光散射、圓二色譜、TEM等證明了Ce6-ELP@TM/MM的成功制備，且具有良好的膠體穩(wěn)定性及聲動(dòng)力學(xué)特性，其平均尺寸約為58 nm（圖2）。

圖2.（a）Ce6-ELP在氘化DMSO中的¹H NMR譜。（b）ELP和Ce6-ELP的熒光發(fā)射光譜（激發(fā)波長(zhǎng) =  405 nm）。（c）用芘作為熒光探針測(cè)定得到的Ce6-ELP納米膠束的CMC。（d）不同處理后Ce6-ELP納米膠束的水動(dòng)力尺寸分布。（e）超聲輻照前后ELP或Ce6-ELP的圓二色譜。（f-g）Ce6-ELP@TM（插圖為Ce6-ELP@TM的尺寸分布直方圖）和Ce6-ELP@TM/MM的TEM圖像（比例尺為50 nm）。（h）Ce6-ELP@TM/MM分散在水中、PBS或含有10% FBS的DMEM中的水動(dòng)力學(xué)尺寸（n = 3）。（i）在超聲輻照后的TEMP捕獲的¹O₂的ESR譜圖（[Ce6] = 5 μg/mL, 1.0 MHz, 1.0 W/cm², 30 s）。

  隨后，團(tuán)隊(duì)通過流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦分析了腫瘤細(xì)胞對(duì)Ce6-ELP@TM/MM的攝取行為，并以CCK-8法初步評(píng)估了納米藥物的體外抗腫瘤效果（圖3），并以此結(jié)果確定了后續(xù)實(shí)驗(yàn)中超聲施加的條件及藥物使用濃度。

圖3. （a）C6細(xì)胞與Ce6-ELP@TM/MM培養(yǎng)不同時(shí)間后的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果（n = 3）。C6細(xì)胞與不同材料孵育4小時(shí)后的激光共聚焦圖像（b，比例尺為40 μm）。（c）在沒有超聲的情況下，C6細(xì)胞與不同材料培養(yǎng)24小時(shí)后的活力（n = 6）。（d）在不同條件下，Ce6與C6細(xì)胞共培養(yǎng)后經(jīng)不同條件超聲照射（1 MHz）的活力（n = 6）。（e）不同材料與C6細(xì)胞共培養(yǎng)后在超聲照射下的細(xì)胞活力（1 MHz、1 W/cm²和40 s，n = 6）。在圖c-e中，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*表示p < 0.05，***表示p < 0.001。

  接下來，團(tuán)隊(duì)深入研究了Ce6-ELP@TM/MM對(duì)C6細(xì)胞的詳細(xì)治療機(jī)制。通過細(xì)胞活死染色、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞內(nèi)的ROS、線粒體膜電位等的檢測(cè)證實(shí)了，該納米藥物的化學(xué)動(dòng)力學(xué)和聲動(dòng)力學(xué)治療效果（圖4）。以蛋白質(zhì)免疫印跡分析評(píng)估了癌細(xì)胞經(jīng)納米藥物處理后，細(xì)胞內(nèi)的STING通路的激活狀態(tài)，證明了Mn²⁺在細(xì)胞STING通路激活過程中的作用。

圖4.（a）不同材料處理C6細(xì)胞在超聲存在或不存在條件下的活、死染色結(jié)果（比例尺= 100 μm）。（b）經(jīng)不同處理后的C6細(xì)胞的凋亡流式細(xì)胞術(shù)分析（n = 3）。（c-f）經(jīng)不同處理的C6細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化的流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果及定量分析（n = 3）。（g）經(jīng)不同處理后的C6細(xì)胞內(nèi)的線粒體膜電位變化檢測(cè)結(jié)果（比例尺= 20 μm，1 W/cm², 30 s, 1 MHz）。在圖d和f中，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。

  團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步研究了納米藥物在超聲輻照下誘導(dǎo)免疫源性細(xì)胞死亡的效果。通過胞外ATP和HMGB-1研究及激光共聚焦顯微鏡觀察表明，超聲輻照下，納米藥物能夠?qū)е?/span>ATP分泌及HMGB-1釋放增加（圖5b-c），同時(shí)能引起胞內(nèi)大量的CRT外翻至細(xì)胞膜上（圖5d），從而說明其可在體外誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生免疫原性死亡。隨后，Transwell實(shí)驗(yàn)證明了引起的ICD能夠引起樹突細(xì)胞熟化（圖5e）。

圖5.（a）經(jīng)不同材料處理后C6細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的免疫熒光染色結(jié)果。不同處理后C6細(xì)胞釋放ATP（b）、HMGB1的水平（c）和C6細(xì)胞膜表面暴露CRT的水平（d）；不同處理的C6細(xì)胞與樹突細(xì)胞共孵育示意圖及樹突細(xì)胞熟化情況（e）；在圖c-d中，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。

  該納米藥物攜帶的Mn²⁺和Ce6分別具備MR成像和熒光成像的特性，通過對(duì)巨噬細(xì)胞膜仿生前后的納米藥物在腦部聚集情況的分析，驗(yàn)證了Ce6-ELP@TM/MM能夠跨越血腦屏障實(shí)現(xiàn)高效的腦部遞送（圖6）。

圖6.（a）尾靜脈注射Ce6-ELP@TM或Ce6-ELP@TM/MM前后不同時(shí)間點(diǎn)后的原位腦膠質(zhì)瘤小鼠模型的T₁加權(quán)MR圖像。（b）尾靜脈注射不同時(shí)間點(diǎn)后原位腦膠質(zhì)瘤小鼠模型的體內(nèi)和（c）離體器官熒光圖像。不同處理組荷瘤小鼠的膠質(zhì)瘤MR信號(hào)強(qiáng)度定量分析（d）、熒光強(qiáng)度分析（e）和離體主要器官熒光強(qiáng)度分析（f）（[Ce6] = 5 mg/kg，每只小鼠200 mL PBS，n = 3）。在圖d-f中，ns表示無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，*表示p < 0.05，***表示p < 0.001。

  隨后，團(tuán)隊(duì)通過建立C6原位腦膠質(zhì)瘤模型，研究了Ce6-ELP@TM/MM的體內(nèi)抗腫瘤治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同材料處理后，施加超聲明顯增強(qiáng)了治療效果，大大抑制了腫瘤的生長(zhǎng)，這表明聲動(dòng)力治療聯(lián)合化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療后比單一的化學(xué)動(dòng)力學(xué)治療效果更佳（圖7）。通過免疫組化和免疫熒光切片進(jìn)一步驗(yàn)證了納米藥物的體內(nèi)治療效果及其在體內(nèi)對(duì)STING的激活情況。

圖7.（a）Ce6-ELP@TM/MM納米復(fù)合物的荷瘤小鼠體內(nèi)治療過程示意圖；（b）不同治療組的代表性MR圖像（1：PBS；2：PBS + US；3：Ce6-ELP@TM；4：Ce6-ELP@TM + US；5：Ce6-ELP@TM/MM；和6：Ce6-ELP@TM + US）以及不同處理后各組相對(duì)腫瘤體積（c）和小鼠體重（d）定量分析（c-d組，n = 5）。（e）腫瘤的免疫組織化學(xué)（H&E和TUNEL）和免疫熒光染色（p-STING）結(jié)果（標(biāo)尺為50 μm）。在圖c中，*表示p < 0.05，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001。

  隨后，團(tuán)隊(duì)研究了Ce6-ELP@TM/MM納米藥物介導(dǎo)的聯(lián)合治療后的體內(nèi)免疫響應(yīng)。結(jié)果表明，Ce6-ELP@TM/MM在施加超聲后，腫瘤和脾臟CD4⁺T細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞的數(shù)量上調(diào)最為明顯，腫瘤部位的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）顯著下調(diào)，證明通過聲動(dòng)力/化學(xué)動(dòng)力/免疫聯(lián)合治療后能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的殺傷和效應(yīng)性T細(xì)胞，從而增強(qiáng)抗腫瘤治療效果（圖8）。

圖8. 不同處理后血清中TNF-α（a）、IFN-β（b）、IL-6（c）的相對(duì)水平（n = 3）。不同處理后腦內(nèi)CD11c+CD80+DC的百分比（n = 3）（d）。（e）不同處理后腦內(nèi)CD3+CD4+ T細(xì)胞和（f）CD3+CD8+ T細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果（n = 3）。（g）不同處理后脾臟CD3+CD4+ T細(xì)胞和（h）CD3+CD8+ T細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果（n = 3）（a-d組中，**表示p < 0.01，***表示p < 0.001）。

  以上研究以“Biomimetic metal-phenolic network-coated elastin-like polypeptide micelles as an immunogenic cell death inducer for orthotopic glioma sonodynamic-chemodynamic-immune therapy”為題，發(fā)表于國際著名期刊Nano Today上。東華大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院博士研究生王志強(qiáng)為第一作者，東華大學(xué)史向陽教授為通訊作者。該工作得到了國家自然科學(xué)基金委、上海市科委等項(xiàng)目的資助。

  原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.nantod.2025.102810