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  骨組織獨(dú)特的生理環(huán)境為骨轉(zhuǎn)移相關(guān)疾病的治療帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)，尤其現(xiàn)有的核酸遞送系統(tǒng)，如脂質(zhì)納米顆粒（LNP）和聚乙烯亞胺（PEI），難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的骨靶向，嚴(yán)重限制了核酸藥物在骨科領(lǐng)域的應(yīng)用。

  為應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn)，同濟(jì)大學(xué)杜建忠教授/朱云卿研究員和同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院骨科賀石生教授在此前聚酰胺胺Pabol的研究基礎(chǔ)上（Chem. Mater. 2024, 36, 5422-5435.），進(jìn)一步引入骨親和分子阿侖膦酸（ALN），成功設(shè)計(jì)了一種新型骨靶向核酸遞送載體——聚[阿侖膦酸-co-(N,N′-雙(丙烯酰)胱胺-co-4-氨基-1-丁醇)]（ALN-Pabol）。該載體不僅能精準(zhǔn)遞送miRNA至骨轉(zhuǎn)移瘤區(qū)域，還具備生物可還原、可降解、高包封效率、低毒性等優(yōu)勢(shì)，為骨組織疾病的核酸治療提供了新策略。

  具體研究思路如圖1所示：ALN-Pabol通過(guò)靜電作用與治療性miRNA結(jié)合，形成穩(wěn)定的ALN-Pabol/miRNA納米復(fù)合物。該復(fù)合物在ALN的引導(dǎo)下精準(zhǔn)定位骨組織，并在腫瘤高谷胱甘肽環(huán)境中響應(yīng)性釋放miRNA，激活抑癌基因GPER1以抑制腫瘤增殖并促進(jìn)其凋亡。同時(shí)，ALN通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性緩解乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的溶骨性損傷，以此實(shí)現(xiàn)抗腫瘤+抗骨吸收雙重療效。

圖1. 骨靶向ALN-Pabol/miRNA納米復(fù)合物的制備以及其用于治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移瘤和相關(guān)溶骨性破壞的示意圖。

  為了避免納米復(fù)合物由于粒徑過(guò)小而被腎臟清除、提升其在腫瘤組織中的滲透性和滯留能力，納米復(fù)合物的粒徑范圍需要控制在50~500 nm范圍內(nèi)，且確保粒徑分布均勻。此外，納米復(fù)合物表面的正電荷對(duì)核酸遞送效率有重要影響：較高的正電荷有助于提高細(xì)胞攝取率和轉(zhuǎn)染效率，但也可能導(dǎo)致更高的細(xì)胞毒性，因此需在效率與生物安全性之間取得平衡。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)粒徑與電荷的精準(zhǔn)調(diào)控，團(tuán)隊(duì)優(yōu)化了多個(gè)制備參數(shù)，包括聚合物與miRNA的質(zhì)量比、緩沖液pH值、miRNA濃度、滴定速度及混合過(guò)程中的攪拌速度，最終成功制備出具備理想粒徑、粒徑分布及表面電荷特性的ALN-Pabol/miRNA納米復(fù)合物（圖2A, B）。通過(guò)透射電子顯微鏡（TEM）表征了納米復(fù)合物的結(jié)構(gòu)（圖2C）。包封效率測(cè)定結(jié)果顯示，Pabol、ALN_0.1-Pabol和ALN_0.2-Pabol的包封效率分別為91.7%、94.9%和96.8%，均超過(guò)90.0%，與當(dāng)前主流商用遞送系統(tǒng)如PEI 25K和LNP相當(dāng)，表明制備的聚合物載體具有優(yōu)異的核酸包載能力（圖2D）。

圖2. (A, B) 在最佳滴定條件下形成的各種聚合物/miRNA納米復(fù)合物的流體力學(xué)直徑 (D_h)、多分散性 (PD) 和zeta電位(ζ)。(C) 用1.0 wt %中性磷鎢酸染色的ALN_0.1-Pabol/miRNA復(fù)合物的TEM圖像。(D) 不同納米復(fù)合物的包封率。

  阿侖膦酸（ALN）分子中的膦酸基團(tuán)可與骨骼羥基磷灰石中的Ca2?離子發(fā)生穩(wěn)定的雙齒螯合作用，賦予其對(duì)骨組織的高度親和性。因此，修飾了ALN的ALN-Pabol/miRNA納米復(fù)合物能夠與骨組織特異性結(jié)合，從而具備出色的骨靶向特性。在體外骨親和性實(shí)驗(yàn)中，ALN接枝率為10.0%的ALN_0.1-Pabol與羥基磷灰石粉末的結(jié)合率比Pabol高17.1%。進(jìn)一步比較不同遞送系統(tǒng)后發(fā)現(xiàn)，ALN-Pabol/miRNA納米復(fù)合物與羥基磷灰石粉末的結(jié)合率分別比Pabol/miRNA、PEI/miRNA和Lipo/miRNA高17.6%、31.5%和33.6%（圖3），充分證明其優(yōu)異的骨組織親和能力。此外，尾靜脈注射48小時(shí)后的解剖熒光定量結(jié)果也印證了其骨靶向性能。與非靶向的Pabol/miRNA相比，ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物在骨組織部位的熒光信號(hào)顯著增強(qiáng)，表明該系統(tǒng)在體內(nèi)同樣具有高度骨組織富集能力（圖4）。

圖3. (A) 吸附在羥基磷灰石片上的ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物的熒光顯微鏡圖像。(B) 各納米復(fù)合物與羥基磷灰石粉末的結(jié)合能力。(C) Pabol/miRNA和ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物在HEPES緩沖液中4 ℃下儲(chǔ)存30天的流體力學(xué)直徑及多分散性隨時(shí)間的變化。

圖4. Pabol/miRNA和ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物的體內(nèi)生物分布圖像以及各組織中熒光分布強(qiáng)度的定量分析。

  鑒于ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物在體內(nèi)具備良好的骨靶向性能，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步構(gòu)建了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移小鼠模型，評(píng)估了該遞送系統(tǒng)在骨腫瘤治療中的實(shí)際療效。結(jié)果如圖5所示，與其他組別相比，ALN_0.1-Pabol/miRNA組裸鼠的骨腫瘤重量最小。免疫組化以及免疫熒光結(jié)果顯示，該組裸鼠的腫瘤細(xì)胞中處于增殖狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞最少，處于凋亡狀態(tài)的腫瘤細(xì)胞最多。這些結(jié)果表明該遞送系統(tǒng)可有效激活抗腫瘤通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)其凋亡。

圖5. (A) 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移模型的建立以及治療周期示意圖。(B) 治療完成后荷瘤腿的照片。(C) 不同治療后從荷瘤腿上收集的腫瘤的平均重量。(D, E) 通過(guò) Ki67 染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞治療后的增殖狀態(tài)。(F) 通過(guò)TUNEL染色評(píng)估腫瘤細(xì)胞治療后的凋亡狀態(tài)。

  團(tuán)隊(duì)還通過(guò)micro-CT成像技術(shù)進(jìn)一步對(duì)ALN_0.1-Pabol/miRNA在抑制骨溶解方面的效果進(jìn)行了深入分析。如圖6所示，PBS組和裸miRNA組小鼠在脛骨部位顯示出了明顯的骨折和骨溶解現(xiàn)象，而經(jīng)ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物治療后，小鼠脛骨結(jié)構(gòu)明顯更為完整，骨溶解程度顯著降低，骨組織形態(tài)與健康對(duì)照組幾乎無(wú)異，療效遠(yuǎn)優(yōu)于其他處理組。進(jìn)一步的骨骼結(jié)構(gòu)參數(shù)定量分析顯示，經(jīng)ALN_0.1-Pabol/miRNA納米復(fù)合物治療后，小鼠骨骼的各項(xiàng)指標(biāo)（如骨體積、骨密度等）均恢復(fù)至接近正常水平，充分證明該遞送系統(tǒng)在抑制骨轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)骨破壞方面具有顯著療效。

圖6. (A) 不同治療后荷瘤脛骨的micro-CT圖像。(B) 不同治療后小鼠荷瘤脛骨結(jié)構(gòu)參數(shù)的定量分析。

  綜上所述，團(tuán)隊(duì)構(gòu)建了一種基于可降解陽(yáng)離子聚合物和阿侖膦酸（ALN）基團(tuán)的新型核酸遞送系統(tǒng)——ALN-Pabol，其在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出優(yōu)異的骨靶向能力，能夠有效封裝治療性核酸并形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的ALN-Pabol/miRNA納米復(fù)合物，其在骨組織中實(shí)現(xiàn)了精準(zhǔn)遞送與局部釋放，顯著提升了對(duì)骨轉(zhuǎn)移瘤的治療效果。ALN的引入不僅顯著增強(qiáng)了納米復(fù)合物的骨親和力，而且有效降低了系統(tǒng)性毒性。總之，ALN-Pabol為骨靶向基因治療提供了一種新方法，具有廣泛的適應(yīng)潛力，有望拓展至骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、骨肉瘤等多種骨相關(guān)疾病的治療。

  該研究成果近期以“Bone-Targeting Nucleic Acid Delivery Polymer Vector for Effective Therapy of Bone Metastasis”為題發(fā)表在《ACS Nano》上。同濟(jì)大學(xué)高分子材料系碩士研究生李澤娟、同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院博士研究生肖霄為論文的共同第一作者，賀石生教授、杜建忠教授和朱云卿研究員為共同通訊作者。該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金等資助。

  鏈接地址：https://doi.org/10.1021/acsnano.5c04743